グリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質の生合成に関する分子的洞察

Nature Communications volume 13、記事番号: 2617 (2022) この記事を引用

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真核細胞は、受精、神経新生、免疫において重要な役割を果たす豊富なグリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質（GPI-AP）で覆われています。疎水性シグナルペプチドの除去と新しいカルボキシル末端での GPI の共有結合は、すべての真核生物で保存されている小胞体膜 GPI トランスアミダーゼ複合体 (GPI-T) によって触媒されます。今回我々は、ヒト GPI-T の低温電子顕微鏡 (cryo-EM) 構造を世界分解能 2.53 Å で報告し、等モルのヘテロ五量体集合体を明らかにしました。構造に基づく突然変異誘発は、プロタンパク質基質の認識と切断のためのレグマイン様の機構を示唆しており、構造内の内因性 GPI が脂質基質の複合空洞を定義します。この細長い活性部位は、膜に由来し、触媒ダイアドに向かってさらに約 22 Å の空間に広がり、この幾何学形状に一致する両親媒性パターンを特徴とする両方の基質に構造的に適しています。私たちの研究は、GPI-AP 生合成の機構の理解に向けた重要な一歩を示しています。

GPI アンカリングは、真核生物の細胞表面タンパク質の遍在的で代謝的に高価な翻訳後修飾を表します 1、2、3、4、5。 1980 年代に構造が解明された 6 ように、GPI 脂質は生理活性があり 7 、化学的に多様であり、多糖コア α-Man3-(1 → 2)-α-Man2-(1 → 6)-α-Man1 に結合したホスファチジルイノシトール基からなる最小限の骨格を備えています。 -(1→4)-α-GlcN（Man1/2/3、3つのマンノース、GlcN、グルコサミン、括弧内の数字は炭素番号を示します）（図1a、補足図1a）。成熟 GPI のグリカンコアには追加の官能基が含まれており、その一部は種および組織に特異的です。成熟プロセスには、マンノシルトランスフェラーゼやホスホリルエタノールアミン（EtNP）トランスフェラーゼなどの複数の酵素が関与します（補足図1b）2、3、4。 Man1 の C2 上の EtNP は Man38,9 の酵素的付加の前提条件であり、その後、2 つの EtNP が Man3 の C6 (GPI アンカリング用のリンカーとして) および Man2 (効率的な小胞体 (ER) ゴルジのため) に順次転移されます。一部の GPI-AP のトランスポート）2. C2 での Man3 のマンノシル化は、酵母などの一部の種における GPI アンカーリングに不可欠です 10。一部のトリパノソーマ種では、Man2のC3、およびMan1のC3 / C4はさらに糖装飾を持つことができ、GlcNのC6はアミノエチルホスホネートで修飾されます（参考文献11に要約されています）（補足図1a）。ホスファチジルイノシトール部分に関しては、アシル鎖は通常、GPIアンカーリングの前にイノシトールのC2に存在しますが（補足図1a）、ほとんどの場合（赤血球を除く）GPI付着直後に除去されます3。最後に、ホスファチジル基の脂肪鎖もGPI結合ステップの前（補足図1b）と後の両方でリモデリングを受け、ジアシルグリセロール、アルキルアシルグリセロール、またはさまざまな長さと不飽和を持つセラミドなどのアシル多様性を引き起こします2、3、4、11。。

GPI-T は、アミノ基転移反応により、プロタンパク質の C 末端シグナルペプチド (CSP) の ω 残基 (青色) を GPI に置き換えます。さまざまな部品が破線のボックス内に示されています。 EtNP、リン酸エタノールアミン; 男、マンノース。 Ino、イノシトール。 GlcNH2、グルコサミン。 ω、ω+1、ω+2、および ω+3 部位の優先順位は、一文字で省略されたアミノ酸を備えた破線のボックス内に示されています。灰色の陰影は小胞体 (ER) 膜を示します。 b GPI-T はゲル濾過でガウスに近いピークを示し、5 つのサブユニットすべてが SDS-PAGE (挿入図) 上に存在し、ゲル内蛍光 (左) およびクーマシー染色 (右) によって視覚化されます。 Vo と Vt (三角形) はそれぞれ空隙と総体積を示します。 Vo より前のバックグラウンド吸光度シグナルは完全には示されていません。 G/T/S/K/U はサブユニット GPAA1/PIGT/PIGS/PIGK/PIGU を指します。各サブユニットの位置は、複合体を単独で発現したサブユニットと比較することによって個別に決定されました。アスタリスクは軽度の汚染物質を示します。タンパク質マーカーの分子量は右側に示されています。 3 つの独立した実験の代表的な結果を示します。トリミングされていない画像はソースデータで提供されます。 c Cryo-EM マップ (i-iii) および ER 内腔 (iv) またはサイトゾル (v) からの膜貫通ドメインの通常のビュー。 iv と v の数字は TMH を示し、G/T/U/S/K はそれぞれ GPAA1 と PIGT/U/S/K を指します。脂質と界面活性剤は棒 (灰色) で表示されます。サブユニットおよび関連するクライオ EM 密度は、示されているように色分けされています。

95% viability) at a density of 2 × 106 mL−1 were diluted 2 times and cultured at 37 °C in a 3 L flask in a CO2 incubator to re-reach 2 × 106 mL−1 (typically takes one day). Six milligrams of plasmids and 12 mg of PEI were mixed in 100 mL of medium for 20 min at RT before being added into 1 L of cell culture. Sodium valproate (Cat. P4543, Sigma) was added to a final concentration of 2 mM. Cells were harvested after 48 h by centrifugation at 1500 g for 15 min, washed once with PBS buffer, flash-frozen in liquid nitrogen, and stored at −80 °C until use./p>